Métodos de predicción de ADN y ARN¶
Detección gráfica de ORF¶
Vamos a localizar pautas abiertas de lectura en dos secuencias. Utilizaremos el programa plotorf.
Descargar las secuencias genomic_frataxin.fasta y mRNA_frataxin.fasta.
El programa que vamos a utilizar es plotorf.
plotorf 'sequence'
Analizar ambas secuencias, localizar las ORFs y describir las diferencias.
Construcción de mapas de restricción¶
Existen varios programas que nos indican las dianas de corte de enzimas de restricción. Nosotros vamos a utilizar remap y la secuencia mRNA_frataxin.fasta.
remap 'file'
Vamos a seleccionar todos los enzimas con sitio de corte 6pb.
Traducción de pautas de lectura¶
Ahora vamos a traducir la pauta de lectura que contiene la ORF en el mRNA de la frataxina.
transeq -frame 'x' 'sequence'
En un editor de textos vamos a eliminar las regiones no traducidas, el 5’ antes de la metionina y los aminoácidos desde el stop al 3’.Salvar el fichero una vez modificado.
¿Como sabemos cual es la metionina de inicio?. Para ello, necesitamos o datos experimentales o comparar con proteinas conocidas. Hacer un blastp con esta secuencia contra la base de datos nr de la NCBI.
Corregir si es necesario la secuencia de la proteína.
Detección de la pauta de lectura y la estructura intrón/exón en el genómico¶
En el genómico no podemos traducir directamente, primero tenemos que determinar la estructura exónica. Vamos a realizarlo de dos modos.
Mediante comparación de bases de datos¶
Un modo fácil es comparar nuestra secuencia con proteinas conocidas.
Realizar un blastx contra la refseq con la secuencia genomic_frataxin.fasta en la NCBI.
Con la información que nos proporcionan los alineamientos de los diferentes HSPs podemos reconstruir la estructura exónica.
Anotar y reconstruir sobre papel la estructura del gen.
Mediante comparación con mRNA del gen¶
Otra forma de hacerlo es alinear ESTs o mensajeros del gen con la región genómica. Existen programas especialmente diseñados para este proposito: Est2genome y Esim4.
est2genome 'mrna_seq' 'genomic_seq'
Comparar esta estructura del gen con la que habeis hecho vosotros utilizando el bastx.
¿Son equivalentes? ¿A qué se deben las diferencias?.
Predicción de estructuras génicas. GeneMark¶
Existen programas que van a combinar la información del uso del tercer codón, las pautas y los sitios aceptores y dadores del procesado para realizar predicciones de las estructuras del gen y pautas codificantes. Nosotros vamos a ver el Augustus.
Utilizaremos la secuencia genomic_frataxin.fasta.
Seleccionar las opciones: Drosophila melanogaster.
Analizar los resultados y compararlos con nuestras predicciones de proteina. Podeis hacer un blastp con la proteina predicha por Augustus y comprobar si esta bien predicha
Repetir el ejercicio con la secuencia genomic_frataxin2.fasta.
¿Son diferentes las predicciones? ¿Son diferentes las proteínas predichas?.
Para comprobar que hay de diferente en las secuencias alinear ambas secuencias (genomic_frataxin.fasta y genomic_frataxin2.fasta).
water 'file' 'file'
Comentar que ha sucedido y como lo ha solucionado el programa.
Diseño de cebadores para amplificación de exones¶
Estamos interesados en amplificar los exones del 1 y 2 del gen c-fos humano. Identifica los exones e intrones del gen y utilizando el programa Primer3 (está en el Jemboss) diseña cebadores flanqueantes a los exones 1 y 2. Intenta que ambos productos puedan ser amplificados con las mismas condiciones de PCR.
